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2021年6月27日，风投首个体内CRISPR基因编辑安全性和效果的盯上的项临床数据在NEJM公布，结果表明单次静脉注射CRISPR可精确编辑体内的技术靶细胞，治疗基因疾病。有望
导语：众所周知，从根在体基因编辑可以通过对体内靶细胞的本上基因编辑，敲除致病基因或插入功能性基因，治疗以治疗从前被认为无法治愈的癌症疾病，如遗传病和癌症等。谷歌2020年，风投CRISPR基因编辑技术荣获诺贝尔化学奖；2021年6月27日，盯上的项首个体内CRISPR基因编辑安全性和效果的技术临床数据在NEJM公布，结果表明单次静脉注射CRISPR可精确编辑体内的有望靶细胞，治疗基因疾病。从根
基因编辑技术可从根本上治疗癌症
基因编辑技术多用于基因功能研究和疾病治疗，常用工具包括锌指核糖核酸酶（Zinc Finger Endonuclease，ZFN）、转录激活样效应因子核酸酶（Transcription Activator Like Effector Nuclease，TALEN）和CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-associated）系统（表1）。
表1 三种基因编辑技术的比较
数据来源：[1]丨制表：生物探索编辑团队
CRISPR/Cas系统广泛存在于细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，主要由两部分组成：编码Cas蛋白的基因和由前导序列、不连续的重复序列、长度相似间隔序列组成的CRISPR序列。其应用条件包括：待编辑区域有保守的PAM序列（Proto-spacer Adjacent Motifs）、可与PAM上游序列互补配对的sgRNA和发挥功能的Cas酶。与传统的基因编辑工具相比，CRISPR/Cas系统优点突出。
根据效应蛋白的不同，CRISPR/Cas系统分为两类（图1）：1类系统是由多种不同效应蛋白组成的复合物，通常形成多亚基蛋白crRNA（CRISPR RNA）效应复合物，包括I、Ⅲ和Ⅳ三种类型和12种亚型；2类系统只有单个效应蛋白（Cas9、Cas12、Cas13）进行目的基因的干扰，约占CRISPR/Cas系统的10%，包括II、Ⅴ和Ⅵ型和9种亚型，除了切割DNA，2类系统中的Cas13a （C2c2）可以靶向切割ssRNA （Single-stranded Ribonucleic Acid）。
图1 CRISPR/Cas系统的分类（图源：[1]）
CRISPR/Cas系统的作用机制分为三个阶段（图2）：
(1) 适应：摄取外源遗传物质
外源遗传物质入侵后，CRISPR/Cas系统识别外源基因的PAM序列，并从PAM序列附近获取部分外源片段形成间隔序列，从5’端整合到CRISPR重复序列之间使之具有“记忆”，可在下次感染时对入侵核酸特异性破坏，多数已知的CRISPR/Cas系统在此过程中需要Cas1-Cas2复合物的参与。
(2) 表达：crRNA的表达和成熟
CRISPR区域首先转录成pre-crRNA，之后被切割为包含1个间隔序列和部分重复序列的成熟crRNA，直接或进一步加工后与Cas蛋白结合成“效应子”或“干扰”复合物，具有特异性核酸内切酶活性。
(3) 干扰：对外源遗传物质进行剪切
复合物在crRNA的引导下沿外源遗传物质进行扫描，当遇到PAM序列附近有crRNA匹配区域，效应复合物进行切割促进核酸分子降解，外源核酸表达沉默。
Cas9属于2类Ⅱ型CRISPR系统，自2013年在人类细胞中得到验证以来成为应用最广泛的基因组编辑工具，为了使其有更大的作用范围，这一工具的开发也在不断深入。
图2 CRISPR/Cas作用机制示意图（图源：[1]）
肿瘤是由体细胞突变积累形成的，根据癌症类型有不同的突变基因及突变位点。传统的癌症治疗方法效果有限，复发性高，通过基因编辑技术使致癌基因失活或抑癌基因激活，进而改变下游信号通路进行癌症治疗，可以从根本上治疗疾病。CRISPR/Cas9作为一种基因编辑工具，可用于开展同源定向修复、基因敲除、插入、染色体异位、染色质重组、疾病诊断等工作。目前，CRISPR/Cas9技术已应用于肿瘤治疗中的基础研究（表2）及生物治疗（表3）。
表2 CRISPR/Cas9在肿瘤治疗中的基础研究
数据来源：[1]丨制表：生物探索编辑团队
表3 CRISPR/Cas9介导的肿瘤生物治疗
数据来源：[1]丨制表：生物探索编辑团队
CRISPR技术优势突出，临床应用如何
2021年6月17日，The New England Journal of Medicine（NEJM）报道了世界首例支持体内CRISPR基因编辑安全性和效果的临床数据（图3）。此项研究由伦敦大学医学部国家淀粉样变性中心、伦敦圣乔治大学、皇家自由学院、奥克兰大学和新西兰临床研究等团队共同完成，并由Intellia Therapeutics和Regeneron联合赞助。
图3 研究成果（图源：NEJM）
转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTR）是一种危及生命的疾病，其特征是错误折叠的转甲状腺素蛋白（TTR）蛋白主要在神经和心脏中进行性积累。NTLA-2001是体内基因编辑治疗剂，旨在通过降低血清中TTR浓度来治疗ATTR淀粉样变性。NTLA-2001基于成簇规则间隔的短回文重复序列和相关的Cas9核酸内切酶（CRISPR-Cas9）系统，通过脂质纳米颗粒封装Cas9蛋白的信使RNA和靶向TTR的单向导RNA（图4）。
图4 NTLA-2001的作用机制（图源：NEJM）
此项研究公布的中期临床数据涵盖了在1期临床试验中接受治疗的6名ATTR患者，其中3名接受剂量为0.1 mg/kg的NTLA-2001的治疗，另外3名接受的剂量为0.3 mg/kg。通过检测病人血清中TTR浓度水平、NTLA-2001体内药理学、NTLA-2001体外评估、评估不良事件和脱靶效应得到如下结果：
1、接受NTLA-2001治疗的第28天，单剂量的NTLA-2001能够剂量依赖性降低患者血清中的TTR水平。0.1 mg/kg剂量组TTR水平平均下降52%；0.3 mg/kg剂量组TTR水平平均下降87%，其中一名患者TTR水平下降96%；
2、接受NTLA-2001治疗的第28天，NTLA-2001表现出良好的安全性，没有发现严重不良事件和肝脏问题。所有不良事件均为轻度不良事件（1级）；
3、治疗剂量的NTLA-2001并未产生“脱靶效应”。
此项研究资金资助人Intellia总裁兼首席执行官John Leonard博士表示：“有史以来首次体内基因编辑临床数据表明，通过单次静脉输注CRISPR系统，便可在患者体内精准编辑靶细胞，从而治疗遗传疾病。NTLA-2001中期结果验证了假设，其具有在单次给药的情况下中止和逆转ATTR的潜力。解决将CRISPR/Cas9系统靶向递送至肝脏的挑战，也为基于我们的技术平台治疗其他遗传疾病打开了大门，我们计划快速推进和扩展我们的研发管线。这些数据让我们相信，我们正在真正开启医学的新时代。”
谷歌风投看好CRISPR技术，加仓初创公司
2022年3月22日，成立于2017年的Spotlight Therapeutics（以下简称“Spotlight”）宣布获得3650万美元的B轮融资，由此，Spotlight的融资总额达8070万美元。此轮融资由GordonMD Global Investments和EPIQ Capital Group共同领投，Magnetic Ventures以及现有投资者GV（前身为Google Ventures）和Emerson Collective等投资者参投（表4）。
表4 Spotlight Therapeutics融资信息
数据来源：[3]丨制表：生物探索编辑团
Spotlight致力于开发在体CRISPR基因编辑疗法，并拥有专有的技术平台靶向活性基因编辑器（Targeted Active Gene Editors，TAGE）平台。TAGE平台将细胞穿透肽（CPP）、配体和抗体靶向细胞的类别、以及多种核酸酶的原型分子等进行“零件化/模块化”，并建立了一个零件库，通过将这些“零件”/“模块”进行组合，以实现最佳的细胞选择性和功效的分子。这种“零件化/模块化”的方法能够避免当前细胞、病毒和纳米载体递送方法的复杂性和毒性（图5）。
图5 TAGE平台（图源：Spotlight Therapeutics官网）
TAGE能够在体内靶向选定的细胞类型。这有可能提高治疗有效性，并能够编辑当前递送方法不易靶向的细胞类型。TAGE的“零件化/模块化”配置允许通过改变细胞靶向部分、CRISPR效应子和gRNA来创建“合适用途”的分子。同时，TAGE的半衰期短，因此在完成任务后不会在体内持续存在。这就降低了脱靶的风险，最大限度地减少了抗药物免疫反应的可能性，并在剂量方面拥有更大的灵活性。
Spotlight总裁兼首席执行官Mary Haak-Frendscho博士表示：“此次B轮融资是重要的里程碑，这使我们可以推进免疫肿瘤学（IO）项目（图6），同时也可以开展在眼科疾病和血红蛋白病方面的项目。将使我们能够利用Spotlight独特的细胞靶向体内递送方法释放基因编辑的全部潜力，为患者提供有效的一次性治疗药物。”
图6 IO项目（图源：Spotlight Therapeutics官网）
CRISPR/Cas9系统能很好地突破传统诊断、治疗肿瘤方法的局限性，是一种革命性的癌症治疗方式。相信随着研究的不断深入，CRISPR/Cas9会在肿瘤基础研究和临床应用方面发挥更大作用。
题图来源：Spotlight Therapeutics官网，仅用于学术交流。
撰文|文竞择
排版|露娜
参考资料：
[1]马孟丹,杨育宾,陈延萍,等.CRISPR/Cas9技术及其在肿瘤研究与治疗中的应用[J]生命科学,2021,33(11):1370-1381.DOI:10.13376/j.cbls/2021153.
[2]Gillmore JD, Gane E, Taubel J, et al. CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis. N Engl J Med. 2021 Aug 5;385(6):493-502. doi:10.1056/NEJMoa2107454. Epub 2021 Jun 26. PMID: 34215024.
[3]https://www.crunchbase.com/organization/spotlight-therapeutics/company_financials